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生物体的结构是复杂的、有层次的、多级有序的，最重要是含水的。300多年来发展了各种各样的仪器和方法来进行观察，包括光学成像技术、电子显微成像技术和X射线成像技术。20世纪90年代兴起的聚焦离子束切割-扫描电镜成像技术（FIB-SEM）主要应用于半导体行业，21世纪以来才被应用于生命科学来观察细胞或组织内部的结构，是一种高效、快速、自动化的大体积三维成像的方法。FIB-SEM原理是在原位利用聚焦离子束轰击样品感兴趣微小区域表面，将其暴露后，SEM自动获取背散射电子像，这个过程不断重复，就可以获得大量图像序列（图1）。
图1. FIB-SEM工作原理（Benjamin Titze et al. 2016）
目前FIB-SEM可提供的图像最高分辨率约为3nm，样品体积>106μm3，体素尺寸可达3×3×3 nm3。利用FIB-SEM技术，研究人员得到了诸如神经组织连接体、小鼠肝组织、果蝇视叶组织、拟南芥花粉、莱茵衣藻、细菌、寄生虫、细胞或细胞器-细胞膜的相互作用等生物样品的三维重构成果。然而这项技术的一大不足就是需要在常温条件下将样品进行脱水和树脂包埋处理，样品经过固定、染色和干燥会产生假象，从而无法在样品的天然含水状态下观察其内部原始的未被破坏的结构。因此，很多研究学者对冷冻聚焦离子束切割-扫描电镜成像技术（Cryo-FIB-SEM）进行探索（图2），在冷冻体积连续成像、冷冻光电关联成像、冷冻透射扫描成像、冷冻含水切片制备监控、冷冻SEM图像处理等方面取得了很大进展，本文就Cryo-FIB-SEM近年来取得的一些瞩目的研究成果进行综述。
图2. Cryo-FIB-SEM应用领域
Cryo-FIB-SEM连续成像集成了低温成像和大体积数据三维成像的巨大优势，可获取几千立方微米体积的近天然、充分含水冷冻细胞和组织样品的三维图像集（图3），近年来许多研究人员提供了诸如小鼠视神经、枯草芽孢杆菌孢子、海胆胚胎、斑马鱼尾巴、利氏综合征患者细胞等样品结构的分析结果。
图3. 近天然细胞和组织样品的连续Cryo-FIB-SEM体积成像工作流程（Yanan Zhu et al. 2021）
早在2013年研究人员将Cryo-FIB-SEM作为直接的对细胞或组织等大尺寸冷冻样品进行快速三维冷冻成像的工具，观察了通过高压冷冻获得的小鼠视神经和枯草芽孢杆菌孢子冷冻含水样品，生物体内膜结构本身的对比度足以区分高尔基体、囊泡、内质网和线粒体内的嵴等结构，并可对少突胶质细胞和星形细胞中不同类型的线粒体进行三维重构。通过测量核膜平均宽度，研究人员发现由高压冷冻或者冷冻替代所引起的样品收缩远远小于传统的样品处理方法（图4上）。这里的“收缩”是指在化学固定树脂包埋制样方法中由脱水引起的假象。当时，在不激活萌发的情况下对休眠的枯草芽孢杆菌孢子（以下简称孢子）进行成像是不可能的，因为传统的醛类固定可能引起孢子萌发或结构变化，而且由于孢子芯的膜对树脂来说是不渗透的，高压冷冻、冷冻替代和树脂包埋休眠孢子的实验均以失败告终。后来，该实验室研究人员利用Cryo-FIB-SEM获得了包含大量休眠的孢子的样品体积结构数据，并在孢子核中发现了一个局部明亮的信号形成的相互连接，在重构的3D模型中观察分析，像一个丝状网络，这是以前任何其他技术都没有看到的（图4下）。
图4. 少突胶质细胞内线粒体网络三维重构及不同样品制备方法的核膜外观（上）（Andreas Schertel et al. 2013）
图4. 不同显微镜下的枯草芽孢杆菌孢子形态（下）（Andreas Schertel et al. 2013）
2016年研究人员使用Cryo-FIB-SEM方法通过镜筒内（In Lens）二次电子探测器进行大体积样品成像，研究海胆胚胎和斑马鱼幼虫的尾鳍细胞的超微结构，通过同时获取二次电子和背散射电子图像可以逐片获取组织超微结构和重元素材料对比/矿物定位的互补信息，有助于理解不同生物组织的结构和功能。该实验的目标是了解细胞如何产生矿化组织以及形成矿化元素与周围膜之间的空间关系。海胆的胚胎骨骼和斑马鱼的幼虫骨骼都是通过高度不稳定的前体矿物组成，然而在常规样品制备过程中，这种前体矿物容易溶解或改变，但冷冻为玻璃化样品后则保存较好。使用Cryo-FIB-SEM方法，研究人员观察到了海胆胚胎样品中的线粒体、多膜体、内质网、高尔基体、丝状伪足等结构，通过三维视图更好地了解了囊泡在骨针周围的空间方向分布（图5上）。另外，研究人员对斑马鱼尾巴样品进行连续成像三维重构，展示了骨、细胞、血管和细胞外其他区域之间的相互作用，并发现在一深度长达20μm线粒体的网络中存在电子密度高的矿物颗粒（图5下）。
图5. 囊泡在海胆的胚胎骨针周围的空间方向分布（上）（Netta Vidavsky et al. 2016）
图5. 斑马鱼尾骨骼及其矿化颗粒线粒体网络的三维重构和分割（下）（Netta Vidavsky et al. 2016）
2021年研究人员开发并优化了系列Cryo-FIB-SEM体电子显微学成像用于整个玻璃化细胞的三维可视化的工作流程（图3），通过揭示利氏综合征（Leigh Syndrome，LS）患者整个细胞和亚细胞的三维结构，发现LS患者原代成纤维细胞的细胞结构被破坏，证明了该技术在临床和病理上的应用潜力。为了最大限度地提高Cryo-SEM图像的对比度、分辨率与样品总体积、实验时间之间的平衡，该组研究人员测试了一些FIB和SEM成像参数，包括像素间距、FIB切片厚度、FIB和SEM探针电流、加速电压、SEM成像驻留时间和平均线数等。对患者整个成纤维细胞进行切片，SEM成像采用10.5 nm横向像素间距，FIB层厚度为21.0 nm，成像像素为4096X3072，共切2018片，耗时约17.5 h，产生的总体积为58789 μm3。对照组的成像像素是3072X1150，共切575片，耗时约5.5 h，产生总体积为4062 μm3。实验结果表明，LS患者的成纤维细胞呈现明显的细胞结构紊乱，细胞内部被大量来源不明的空泡占据，线粒体的体积明显变小，高尔基体的形态异常。通过三维重构及渲染，在对照组细胞中可见扁圆形管状线粒体网络，而患者细胞的线粒体是分散的，大多是圆形或椭圆形的个体，另外线粒体的嵴结构严重紊乱，数量稀少且较短。患者细胞内的囊泡大小也明显大于对照细胞，而且更丰富和密实（图6）。
图6. 对照组和病人组细胞内部结构的三维重构及渲染（Yanan Zhu et al. 2021）
利用Cryo-FIB-SEM系统，研究人员还揭示了近天然状态下SARS-CoV-2在细胞内的组装和释放路径。研究结果表明，SARS-CoV-2感染的细胞病变效应在整个细胞水平上是深远的，例如在细胞质中有大量各种各样的囊泡用于RNA合成和病毒组装，其形成的膜通道有利于病毒释放或者从细胞质侵入细胞核。此外，还揭示了病毒RNA如何从双层膜泡运输到病毒组装位点，病毒刺突和RNPs如何协助病毒组装和出芽，以及完全组装好的病毒粒子如何脱离细胞。Cryo-FIB-SEM结果还显示，与未感染细胞相比，感染细胞中的线粒体经常被破坏，此外在感染细胞中常见电子致密复合膜泡结构，最显著的特征是细胞核的病变性损伤，其中可见近一半的细胞核被内陷的细胞质所占据。这项研究首次揭示了SARS-CoV-2复制周期在近天然条件下的变化（图7）。这项研究开发的方法和工作流程可以广泛应用于研究其他多种病毒或细菌的感染过程。
图7. SARS-CoV-2感染细胞三维重构及渲染（Luiza Mendonça et al. 2020）
近年来光电关联（CLEM）技术飞速发展，通过将来自荧光显微镜的信息映射到相同样本的电子显微镜的数据，用于研究罕见的、动态的或无法描述的细胞活动，但是将冷冻光镜成像和Cryo-FIB-SEM结合起来的技术还没有普及。2020年Wah Chiu实验室提出了一种集成了三种不同尺度的冷冻成像方式的工作流程（图8），通过使用高分辨率Cryo-Airyscan扫描共聚焦显微镜来确定载网上玻璃化的细胞内荧光目标的z位置，然后使用Cryo-FIB-SEM“切割和观察”的成像技术，当细胞被切割到包含感兴趣目标的片层时即停止，最后用Cryo-ET解析感兴趣区域的分子结构细节，从而揭示了整个热休克酵母细胞的细胞器和亚细胞结构的三维分布，包括招募荧光标记分子伴侣Hsp104的蛋白质包体的超微结构。
图8. 低温条件下通过不同的成像平台进行多个关联成像实验流程（Gong-Her Wu et al. 2020）
2021年金鉴实验室发现荧光标记的脂滴可以作为关联Cryo-FM和Cryo-FIB-SEM数据集的原位基准标记物，并且这种方法可以在低温条件下用于标定几十微米厚的样本（图9）。此外，研究结果还表明，Cryo-FIB-SEM成像对研究细胞内的细胞器结构和细胞器间接触、细胞核组织构成和无机物沉积等方面的问题很有帮助。该研究人员利用Cryo-FIB-SEM成像观察到相邻线粒体之间的相互作用，线粒体的嵴结构以及线粒体基质中的小颗粒结构，观察到细胞核内的异染色质、核仁、核内斑点以及核膜内陷形成的管状结构。这些结果表明，Cryo-FIB-SEM是研究完整含水细胞中有膜或无膜细胞器的三维结构的一种特别有用的方法，尤其是针对常温制样中细胞结构不能完好保存的样品。
图9. 脂滴作为关联Cryo-FM和FIB-SEM数据集的原位基准标记物（Nadav Scher et al. 2021）
虽然建立了Cryo-FIB -SEM作为未染色样本全细胞成像的标准方法，所获得的数据像素大小/体素分辨率已经可以与通过SEM观察到的树脂包埋样品相媲美，但还需要进一步地探索能否在不损害对离子束敏感的玻璃化生物样品的情况下更好地解决成像的衬度，从而提高图像分辨率。2020年Patrick Schultz实验室将没有经过任何染色的冷冻的HeLa细胞，在低温下通过Cryo-FIB-SEM技术使用镜筒内二次电子探测器成像。后期通过对数据集的对齐、去噪、去除离子束窗帘效应和局部电荷不平衡补偿等一系列处理（图10），得到的三维重构结果，提供了接近生理状态的整个HeLa细胞内部各细胞器结构的详细视图，研究结果发现，线粒体、脂质体和溶酶体在细胞内的分布和数量各不相同，线粒体在细胞的一侧极化程度较高，而核孔则均匀分布于整个核膜。另外，该实验室还研究了Cryo-FIB-SEM成像与活细胞蛋白检测相结合的可行性，证明了可以通过低电压的背散射电子来检测内化的金颗粒，同时用二次电子探测器获取信号来对细胞成像。
图10. Cryo-FIB-SEM数据处理步骤（Daniele Spehnera et al. 2020）
利用Cryo-FIB来制备冷冻含水切片技术已在生物学领域广泛应用，然而该过程还存在很多问题，例如感兴趣区域的保存、切片的完整性等。Jan A. Post实验室提出了一种原位检测方法（图11），即通过使用Cryo-FIB-SEM的透射模式（Cryo-FIB-TSEM）来检测冷冻含水切片的完整性，因为每次样品处理和转移都有被污染的风险，导致样品相变或完全丢失。使用Cryo-TSEM对未染色的细胞成像能够产生较强的衬度，可以直接观察切片中的Z-衬度，从而确定薄片内细胞和细胞内结构的存在。此外，样品具有明确的晶态结构，从+2度、0度、-2度来倾斜样品可导致某些区域变得更亮，或保持不变，或变暗，这种亮度变化是由晶体的取向衬度造成的，从而可区分切片中的晶态冰和非晶态冰区域，防止在制样过程中冰晶形成对细胞超微结构的破坏。
技术发展日新月异，总结发现目前的研究结果都显示了一个非常有趣的趋势，不仅要在整个实验过程中控制切片的完整性，而且感兴趣的特征必须精确定位在片层厚度的几百纳米以内，即发展一体化的系统（Cryo-CLEM-FIB-TSEM）。使原位确定感兴趣的区域、原位制备冷冻含水切片、原位切片完整性检查和使用具有透射成像能力的低温扫描电镜进行原位观察，都可以在一台仪器里完成。另外，这种一体化解决方案的主要优点是减少了在转移过程中样品污染或丢失的风险，而且低电压和低剂量成像有可能使更多的图像被记录在断层扫描图中，这也将使低温透射扫描断层成像技术成为一种很有前途的技术，为生命科学的未来研究提供极其强大的工具。
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